Pengenalan
Penyakit tanaman buah boleh melumpuhkan sesuatu industri dalam tempoh singkat, dan racun kimia sahaja jarang memberikan penyelesaian jangka panjang (pengetahuan am). Jalan paling lestari ialah varieti tahan penyakit, tetapi di sinilah masalahnya bagi pokok buah: Jia et al. (2017) menjelaskan bahawa pembiakbakaan sitrus secara tradisional amat sukar kerana poliploidi, poliembrioni, tempoh juvenil panjang dan kitaran kacukan yang lama. Penyuntingan genom menawarkan laluan lebih pantas: satu gen sasaran diubah secara tepat tanpa melalui banyak generasi kacukan.
Artikel ini berpaksikan kajian “Engineering canker-resistant plants through CRISPR/Cas9-targeted editing of the susceptibility gene CsLOB1 promoter in citrus.” (Peng et al., 2017). Objektifnya ialah meningkatkan ketahanan oren Wanjincheng (Citrus sinensis Osbeck) terhadap penyakit kanker sitrus dengan menyunting promoter gen kerentanan CsLOB1 menggunakan CRISPR/Cas9. Negara kajian tidak dinyatakan dalam abstrak. Empat kajian sokongan melengkapkan gambaran: penyuntingan CsLOB1 pada limau gedang ‘Duncan’ (Jia et al., 2017), penyuntingan CsDMR6 (Parajuli et al., 2022), penyuntingan CsWRKY22 (Wang et al., 2019), serta satu ulasan menyeluruh tentang penyuntingan genom tanaman buah (Meena et al., 2026).
Sorotan Kajian Lepas
Asas teknologi ini diletakkan dalam biologi molekul sel haiwan dan mikrob sebelum sampai kepada tumbuhan. Cong et al. (2013) menunjukkan bahawa sistem CRISPR/Cas prokariot jenis II boleh memandu pemotongan DNA pada tapak tertentu menggunakan RNA pemandu, dan nuklease Cas9 dapat diarahkan oleh RNA pendek untuk memotong lokus genom secara tepat dalam sel manusia dan tetikus.
Anders et al. (2014) melaporkan struktur kristal Cas9 daripada Streptococcus pyogenes bersama RNA pemandu molekul tunggal dan DNA sasaran bermotif PAM kanonik 5?-NGG-3?, dan mendapati motif PAM itu terletak dalam dupleks DNA berpasangan bes — maklumat yang membantu pemilihan tapak sasaran.
Peralihan kepada tanaman berlaku apabila vektor yang sesuai dibina. Ma et al. (2015) membangunkan sistem vektor CRISPR/Cas9 mantap menggunakan gen Cas9 dioptimumkan kodon tumbuhan bagi penyuntingan multipleks pada monokot dan dikot, dengan contoh mutasi kehilangan fungsi pada padi dan Arabidopsis T0. Genom rujukan juga diperlukan: Xu et al. (2013) menerbitkan draf genom oren manis (Citrus sinensis).
Dapatan Utama
Matikan gen kerentanan, bukan tambah gen ketahanan. Peng et al. (2017) menerangkan bahawa kanker sitrus disebabkan bakteria Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). Promoter kedua-dua alel CsLOB1 mengandungi elemen pengikatan efektor EBEPthA4, yang dikenali oleh efektor utama Xcc iaitu PthA4, untuk mengaktifkan ekspresi CsLOB1 dan menggalakkan pembentukan kanker. Oren Wanjincheng mempunyai sekurang-kurangnya tiga salinan alel CsLOB1G dan satu salinan alel CsLOB1-.
Kadar mutasi. Lima konstruk pCas9/CsLOB1sgRNA direka untuk mengubah EBEPthA4, dengan kadar mutasi 11.5% hingga 64.7%. Mutan homozigot terhasil terus daripada eksplan sitrus, dan 16 titisan bermodifikasi EBEPthA4 dikenal pasti daripada 38 pokok mutan.
Ketahanan meningkat. Empat titisan mutan (S2-5, S2-6, S2-12 dan S5-13), yang penyuntingan promoternya mengganggu induksi CsLOB1 apabila dijangkiti Xcc, lebih tahan berbanding pokok jenis liar, dan tiada gejala kanker diperhatikan pada S2-6 dan S5-13. Penyuntingan promoter CsLOB1G sahaja sudah mencukupi, manakala pembuangan keseluruhan jujukan EBEPthA4 daripada kedua-dua alel memberikan ketahanan tahap tinggi.
Gen yang sama, varieti lain. Jia et al. (2017) menyunting CsLOB1 pada limau gedang ‘Duncan’ dan menghasilkan enam titisan bebas, dengan kadar mutasi sel 31.58% (DLOB2), 23.80% (DLOB3), 89.36% (DLOB9), 88.79% (DLOB10), 46.91% (DLOB11) dan 51.12% (DLOB12). DLOB2 dan DLOB3 bergejala serupa jenis liar, manakala DLOB9 hingga DLOB12 tidak menunjukkan gejala pada 4 hari selepas inokulasi. Pustul muncul kemudian pada DLOB9 hingga DLOB12 tetapi jauh berkurang, dan pustul pada DLOB9 dan DLOB10 tidak berkembang menjadi gejala kanker biasa. Tiada mutasi luar sasaran dikesan.
Gen sasaran lain memberi kesan lebih kuat. Parajuli et al. (2022) menyunting gen CsDMR6 dan memperoleh enam mutan dalam dua kultivar, limau gedang ‘Duncan’ dan Carrizo citrange. Frekuensi mutasi dalam kebanyakan mutan mencapai 71.8% hingga 98.9%. Mutan menunjukkan pengurangan lesion kanker 71.2% hingga 99.8%, serta pengurangan populasi sel bakteria Xcc melebihi 99.7% atau 2.45 hingga 4.95 unit Log10, selain mengumpul lebih banyak asid salisilik dan mengekspresi gen NPR1 jauh lebih tinggi.
Gen pengawal transkripsi. Wang et al. (2019) menyunting CsWRKY22 pada oren Wanjincheng, yang mengandungi alel CsWRKY22G dan CsWRKY22C dengan nisbah kira-kira 2:1. Daripada empat sgRNA, dua (W1 dan W2) menunjukkan aktiviti pemotongan kuat secara in vitro. Tiga pokok mutan dikenal pasti daripada tujuh pokok transgenik bebas, dengan kadar mutasi 85.7% (W1-1), 79.2% (W2-2) dan 68.2% (W2-3), dan penyuntingan ini menekan perkembangan kanker.
Gambaran lebih luas. Meena et al. (2026) meninjau penggunaan CRISPR/Cas9, Cas12a, Cas13 dan varian penyuntingan bes pada strawberi, pisang (Musa spp.), epal, sitrus (Citrus spp.) dan anggur (Vitis vinifera). Pencapaian penting termasuk ketahanan kulapuk berdebu pada strawberi melalui gangguan gen MLO, ketahanan layu Fusarium pada pisang melalui penyuntingan eIF4E, dan peningkatan likopena pada tomato dengan menyasarkan lokus SlPSY1.
| Perkara | Nilai | Sumber |
|---|---|---|
| Kadar mutasi (promoter CsLOB1, oren Wanjincheng) | 11.5%–64.7% | Peng et al. (2017) |
| Titisan tersunting EBEPthA4 | 16 daripada 38 pokok mutan | Peng et al. (2017) |
| Kadar mutasi sel (limau gedang ‘Duncan’) | 23.80%–89.36% | Jia et al. (2017) |
| Pengurangan lesion kanker (CsDMR6) | 71.2%–99.8% | Parajuli et al. (2022) |
| Pengurangan populasi Xcc (CsDMR6) | >99.7% atau 2.45–4.95 unit Log10 | Parajuli et al. (2022) |
| Kadar mutasi CsWRKY22 | 68.2%–85.7% | Wang et al. (2019) |
Perbincangan
Keempat-empat kajian asal menunjukkan prinsip yang konsisten: menonaktifkan gen kerentanan hos boleh memberikan ketahanan, tetapi bukan semua mutan sama baiknya. Titisan berkadar mutasi rendah (DLOB2 pada 31.58% dan DLOB3 pada 23.80%) masih bergejala seperti jenis liar, manakala titisan berkadar mutasi tinggi hampir bebas gejala — kecekapan penyuntingan, bukan sekadar pemilihan gen, yang menentukan hasil akhir. Penyuntingan CsDMR6 memberikan angka pengurangan penyakit paling tinggi dalam himpunan ini (Parajuli et al., 2022).
Batasannya perlu dinyatakan dengan jujur. Kesemua kajian asal di sini melibatkan satu penyakit sahaja, iaitu kanker sitrus, dan dijalankan pada pokok muda hasil transformasi eksplan, bukan di kebun komersial. Dapatan tentang pisang, strawberi, epal dan anggur datang daripada ulasan Meena et al. (2026), bukan data asal. Tiada kajian asal mengenai penyuntingan pisang untuk layu Fusarium TR4, betik atau buah tropika lain, dan tiada kajian dari Malaysia.
Meena et al. (2026) menekankan cabaran yang masih ada: sistem penghantaran bagi spesies sukar diregenerasi, penyuntingan luar sasaran, halangan peraturan dan akses germplasma. Peraturan tanaman tersunting gen di Malaysia tidak disentuh oleh mana-mana sumber di sini.
Implikasi kepada Agensi dan Penyelidik
1. Anggap teknologi ini terbukti secara saintifik bagi kanker sitrus, tetapi belum sebagai varieti komersial yang diuji di kebun.
2. Tumpukan penyelidikan tempatan kepada pengenalpastian gen kerentanan dalam tanaman utama Malaysia, halangan utama yang disebut dalam kajian CsDMR6.
3. Kekalkan pembiakbakaan konvensional dan pemilihan klon toleran sebagai teras.
4. Rujuk pihak berkuasa berkaitan bagi peraturan dan import bahan tersunting gen.
5. Teruskan pengurusan penyakit bersepadu — bahan tanaman bersih, sanitasi alat, pemantauan awal — kerana ketahanan genetik tidak menggantikan kebersihan kebun (pengetahuan am).
Kesimpulan
CRISPR/Cas9 telah menghasilkan pokok sitrus yang lebih tahan kanker: titisan S2-6 dan S5-13 tanpa gejala (Peng et al., 2017), dan mutan CsDMR6 dengan pengurangan lesion 71.2% hingga 99.8% (Parajuli et al., 2022). Pendekatan menonaktifkan gen kerentanan jelas berkesan, tetapi bukti itu masih tertumpu kepada satu tanaman dan satu penyakit; bagi buah tropika Malaysia, langkah pertama ialah mengenal pasti gen kerentanan tempatan.
Rujukan
1. Peng, A., Chen, S., Lei, T., et al. (2017). Engineering canker-resistant plants through CRISPR/Cas9-targeted editing of the susceptibility gene CsLOB1 promoter in citrus. Plant Biotechnology Journal. https://doi.org/10.1111/PBI.12733
2. Jia, H., Zhang, Y., Orbovi?, V., et al. (2017). Genome editing of the disease susceptibility gene CsLOB1 in citrus confers resistance to citrus canker. Plant Biotechnology Journal. https://doi.org/10.1111/PBI.12677
3. Parajuli, S., Huo, H., Gmitter, F. G., et al. (2022). Editing the CsDMR6 gene in citrus results in resistance to the bacterial disease citrus canker. Horticulture Research. https://doi.org/10.1093/hr/uhac082
4. Wang, L., Chen, S., Peng, A., et al. (2019). CRISPR/Cas9-mediated editing of CsWRKY22 reduces susceptibility to Xanthomonas citri subsp. citri in Wanjincheng orange (Citrus sinensis (L.) Osbeck). Plant Biotechnology Reports. https://doi.org/10.1007/S11816-019-00556-X
5. Meena, D., Rao, V. M. M., Patra, S. K., et al. (2026). Crispr/cas-mediated genome editing in fruit crops: advances, challenges and future directions: a comprehensive review. Plant Archives. https://doi.org/10.51470/plantarchives.2026.v26.supplement-2.128
6. Cong, L., Ran, F. A., Cox, D. M., et al. (2013). Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. https://doi.org/10.1126/SCIENCE.1231143
7. Ma, X., Zhang, Q., Zhu, Q., et al. (2015). A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient, High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants. Molecular Plant. https://doi.org/10.1016/J.MOLP.2015.04.007
8. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A., & Jinek, M. (2014). Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. https://doi.org/10.1038/NATURE13579
9. Xu, Q., Chen, L.-L., Ruan, X., et al. (2013). The draft genome of sweet orange (Citrus sinensis). Nature Genetics. https://doi.org/10.1038/NG.2472
Sumber carian: SciSpace Literature Review (mod High Quality), November 2026.
Kata kunci: CRISPR/Cas9, penyuntingan genom, kanker sitrus, gen kerentanan, CsLOB1, CsDMR6, varieti tahan penyakit, pembiakbakaan buah
